新聞動(dòng)態(tài)
固相合成技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，已成為合成小核酸和多肽藥物的常用方法之一。近年來(lái)，微波輔助合成和流動(dòng)合成技術(shù)的引入進(jìn)一步提升了固相合成的合成效率和產(chǎn)量。然而，這些技術(shù)通常依賴(lài)昂貴且高度專(zhuān)業(yè)化的儀器，限制了其在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中的普及。此外，目前在Fmoc固相合成中廣泛使用的活化試劑HATU，存在熱穩(wěn)定性差和安全隱患。
鑒于此，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)Nicolas Winssinger團(tuán)隊(duì)利用通用的液相分析系統(tǒng)，通過(guò)將其改造用于流動(dòng)化學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高效液相色譜儀（HPLC）到多肽合成儀的轉(zhuǎn)變。
HPLC是常用的分離分析技術(shù)，樣品經(jīng)色譜柱分離組分，實(shí)現(xiàn)樣品的純度檢測(cè)。該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新的在色譜柱前的保護(hù)柱中填充10mg樹(shù)脂作為微型流動(dòng)反應(yīng)器，內(nèi)置2 μm熔塊，以防止樹(shù)脂流失，同時(shí)借助DAD檢測(cè)器（檢測(cè)Fmoc脫保護(hù)副產(chǎn)物）實(shí)時(shí)反饋合成結(jié)果。
該方案采用TBEC（1-叔丁基-3-乙基碳二亞胺）/Oxyma（2-肟氰乙酸乙酯）作為活化體系，無(wú)需額外加堿和預(yù)活化步驟，不僅簡(jiǎn)化了流程，還更加的安全和環(huán)保。
在上述設(shè)備和活化體系基礎(chǔ)上，為探索合成條件，以苯丙氨酸五聚體為模型，在改造的HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行優(yōu)化條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的條件可成功合成目標(biāo)五肽，且實(shí)現(xiàn)粗品純度＞93%單步純度＞99%。
具體方法如下：
整個(gè)合成流程包括如下幾個(gè)階段：
1. 稱(chēng)重及負(fù)載樹(shù)脂：稱(chēng)取10 mg樹(shù)脂（如Rink Amide樹(shù)脂）填入空保護(hù)柱中，密封固定；
2. 樹(shù)脂溶脹：將負(fù)載樹(shù)脂的保護(hù)柱浸入二氯甲烷中，溶脹3-5分鐘；
3. 安裝：設(shè)置柱溫箱溫度為80℃，并將保護(hù)柱安裝至對(duì)應(yīng)支架中；
4. 試劑溶液配備：
樣品溶液：配置0.6 M Fmoc氨基酸、TBEC和Oxyma的NMP溶液，并等體積混合得到0.2M溶液；
脫保護(hù)溶液：在DMF中加入20%體積的哌啶，轉(zhuǎn)入自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶中備用；
5. 編寫(xiě)注射序列程序：設(shè)置儀器交替注射，活化的氨基酸衍生物溶液（用于偶聯(lián)）和20%哌啶的DMF溶液（用于脫保護(hù)）；另外，在合成開(kāi)始前，需連續(xù)進(jìn)行兩次脫保護(hù)，以確保初始Fmoc基團(tuán)完全去除。
6. 樹(shù)脂裂解和脫保護(hù)：將保護(hù)柱浸入二氯甲烷中去除殘余DMF；然后取出樹(shù)脂，浸沒(méi)在TFA溶液中（TFA/三異丙基硅烷T(mén)IS/H2O=95:2.5:2.5），反應(yīng)3小時(shí)，以達(dá)到完全解離和脫保護(hù)。對(duì)于含半胱氨酸，甲硫氨酸等的特殊序列，可使用TFA/1,2-乙二硫醇EDT / TIS / H2O=90 : 5 : 2.5 : 2.5混合裂解液。
7. 產(chǎn)物處理：分離樹(shù)脂，使多肽粗品析出，進(jìn)一步純化。
對(duì)于組氨酸等易消旋的氨基酸及部分特殊氨基酸而言，預(yù)活化時(shí)間對(duì)其偶聯(lián)效率具有顯著影響：該團(tuán)隊(duì)在合成20肽時(shí)，比較了新制活性酯和預(yù)活化24小時(shí)后打的偶聯(lián)效率，發(fā)現(xiàn)Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在長(zhǎng)時(shí)間活化后偶聯(lián)效率比較低。
為進(jìn)一步研究預(yù)活化時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率的影響，以Fmoc-Arg(pbf)-OH為原料分別在預(yù)活化15分鐘和24小時(shí)后合成FRF三肽。結(jié)果顯示，預(yù)活化24小時(shí)后，偶聯(lián)效率顯著降低，歸其原因是Fmoc-Arg(pbf)-OH在活化后，會(huì)經(jīng)歷分子內(nèi)環(huán)化，降低其反應(yīng)性。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，理想的活化溶液應(yīng)在制備4小時(shí)內(nèi)使用。
肽合成過(guò)程中的異構(gòu)化可能會(huì)影響立體化學(xué)純度并改變生物活性。為評(píng)估在該合成條件下的消旋化程度，該團(tuán)隊(duì)采用液相合成方法，對(duì)脯氨酸、半胱氨酸和絲氨酸等易消旋的氨基酸進(jìn)行考察，均未發(fā)現(xiàn)消旋化現(xiàn)象。進(jìn)一步比較TBEC/Oxyma體系和HATU/DIPEA體系的偶聯(lián)效果，團(tuán)隊(duì)采用新鮮活化的His(Trt)進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前者差向異構(gòu)化為3.6%，而后者異構(gòu)化比例為4.8%。
該團(tuán)隊(duì)成功合成了GLP-1（30氨基酸）和比伐盧定（20氨基酸）等多肽，其中使用含10 mg樹(shù)脂的合成柱合成GLP-1的收率為52.1%。而在生物活性方面，用HPLC合成的比伐盧定粗品和通過(guò)常規(guī)SPPS合成的比伐盧定純品具有相似的生物活性（見(jiàn)下圖）。
現(xiàn)成的HPLC應(yīng)用于自動(dòng)化流體合成多肽，具有以下優(yōu)勢(shì)和不足之處：
1. 優(yōu)勢(shì)：
將標(biāo)準(zhǔn)HPLC轉(zhuǎn)變?yōu)槎喙δ芎铣善脚_(tái)；
采用更安全的TBEC/Oxyma活化體系；
可獲得高純度多肽，同時(shí)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控反應(yīng)；
立體選擇性好，可合成復(fù)雜序列多肽；
經(jīng)濟(jì)性好，采用廣泛可用的HPLC設(shè)備，降低設(shè)備成本，可惠及更多實(shí)驗(yàn)室；
靈活性高，可用于多肽/寡核苷酸的合成，還可以通過(guò)更換柱子在合成和純化模式之間切換。
2. 局限性：
對(duì)某些復(fù)雜序列無(wú)法合成；
不同的氨基酸或肽鏈之間的反應(yīng)速率存在差異，需進(jìn)一步優(yōu)化；
合成量較小，僅適用于微克至毫克級(jí)的合成。
該研究提供了一種簡(jiǎn)單、安全且經(jīng)濟(jì)的多肽合成平臺(tái)，利用常規(guī)HPLC系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)和檢測(cè)的同步進(jìn)行。此方案不僅保持了產(chǎn)物的立體化學(xué)完整性，還可以合成具有生物活性的復(fù)雜序列片段，有助于推動(dòng)流動(dòng)合成技術(shù)在更多實(shí)驗(yàn)室中的普及。
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參考文獻(xiàn)：
[1] Romanens, P.; Barluenga, M. D.; Winssinger, N., et al. Peptides on Tap: Automated Flow Synthesis with Standard HPLC [J]. ChemRxiv. 2025.
